高效液相色谱柱是色谱分离的核心。一支合适，稳定，高效的色谱柱对建立普适性强，重现性好的方法是不可少的。因色谱柱是消耗品，随着使用时间或进样次数的增加，会出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰的现象，一般来说是柱效的下降。此时需要对色谱柱进行再生：
(1 )反相柱的再生，采用以甲醇:水=90: 10(V/V),纯甲醇，异丙醇，二氯甲烷等溶剂作流动相，顺次冲洗，每种流动相流经色谱柱的量为20~30倍色谱柱体积然后再以相反顺序冲洗色谱柱。
(2)正相柱再生。顺次以正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作流动相冲洗色谱柱。每步注意平衡溶剂的顺序，不要颠倒。每种流动相流经色谱柱的量为20-30倍柱体积(因异丙醇的粘度较大，冲洗过程中请注意调整冲洗的流速)，用甲醇冲洗完后，再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必需严格脱水。另外，请清洗前严格熟读色谱柱说明书，了解哪些溶剂不可用。
(3)离子交换柱的再生。长时间在高pH值和高离子强度缓冲溶液中使用，将导致色谱柱离子交换能力降低。用稀酸缓冲溶液冲洗，可使阳离子柱再生;反之，用稀碱缓冲溶液冲洗，可使阴离子柱再生。以上色谱柱的再生方法并不是绝对的标准方法，使用者可根据自己的实际经验和目的，选择合适的并能溶解柱内污染物的溶剂作流动相，按正方向或反方向的冲洗。
但是需要指出是，无论采用什么方法再生色谱柱，均不可能*队恢复柱效或其他参数至新柱水平。
另外，对于目前的UPLC柱，由于色谱柱体积越来越小，柱外效应的影响就更加显著，需要更小池体积的检测器(甚至采用柱上检测)，更小死体积的柱接头和连接部件。配套使用的设备应具备如下性能:输液泵能精密输出1-100μL/min的低流量且能提供更高的压力，进样阀能准确、重复地进样微小体积的样品。且由于进样量小，要求高灵敏度的检测器。
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